یکی از روش ھای سریع تولید لاین ھای خالص روش دابلد ھاپلوئیدی می باشد از نظر اصلاحی در گیاھان خودگشن ھمچون غلات، سیستم دابلد ھاپلوئید می تواند مستقیماً جھت تولید ارقام جدید استفاده شود. زیرا ھر لاین دابلد ھاپلوئید تولید شده، در صورت دارا بودن نوترکیبی مطلوب، پتانسیل تبدیل شدن به یک کالتیوار جدید را دارا می باشد.

مزایای اصلی سیستم دابلد ھاپلوئید در مقایسه با روشھای کلاسیک اصلاحی بشرح ذیل است:

1- سرعت بخشیدن به برنامه اصلاحی 2 -افزایش کارایی سلکسیون در طول برنامه

تولید ارقام جديد با استفاده از روش به نژادي ھاپلوئیدي:

نسلھاي مختلف در حال تفكیك ( F1, F2, F3 )ممكن است بعنوان مواد اولیه برنامه به نژادي ھاپلوئیدي مورد استفاده قرار گیرند. بطور كلي سیستم F1 (F1 doubled haploid system) معمول ترين و سريعترين راه جھت دستیابي به نوتركیبي و تولید ارقام جديد مي باشد. به هرحال دو مشكل دراين سیستم وجود دارد:

۱- از آنجائیكه دبلدھاپلوئیدھاي تولید شده از ھیبريدھاي F1 مي باشند و ھیچ گونه گزينشي در مرحله F1 صورت نمي گیرد تعداد نسبتاً زيادي لاين دبلدھاپلوئید جھت دستیابي به نوتركیبي مطلوب (desirable recombination )لازم است .

۲- در سیستم F1بخاطر اينكه يك چرخه نوتركیبي يا میوز انجام پذيرفته كه ممكن است جھت شكستن لینكاژھاي نامطلوب در مواد والدين كافي نباشد ) .(, Snape 1982 )به ھمین خاطر برخي از محققین سیستم F3را ترجیح مي دھند. در اين سیستم گرچه مزيت سرعت بخشیدن به برنامه به نژادي تا حدودي كاھش مي يابد اما تعداد بسیار كمتري لاين دبلدھاپلوئید مورد نیاز خواھد بود و شانس شكسته شدن لینكاژھاي نامطلوب بیشتر است. بھرحال اگر ھدف به نژادگر دستكاري در بخش كوچكي از ژنوم والدين باشد سیستم F1-DH مناسبتر ولي اگر ھدف شكستن لینكاژھاي متعدد در ژنوم والدين باشد سیستم 3F -3-DHبھتر خواھد بود.(Bozorgi-1991 )

روش تولید ھاپلوئید از طريق حذف كروموزومي اولین بار در سال 1970میلادي توسط پروفسور كاشا در كانادا در جو گزارش شد (Kasha & Kao,1970 )كه به لحاظ مزيت ھاي آن به سیستم ھاي ديگر تولید ھاپلوئید مورد توجه قرار گرفت. به طوري كه از آن پس تا كنون در ھر كنگره « ژنتیك جو » يك بخش عمده را به خود اختصاص داده است. روش تولید ھاپلوئید از طريق حذف كروموزومي در گندم در نتیجه تلاقي با ذرت نسبتاً جديد مي باشد كه درسال 1988میلادي توسط دكتر لاري و دكتر بنت در انگلستان گزارش شد (Laurie & Bennet,1988)كه بعد از آن پروژه ھاي تولید ھاپلوئید در گندم با اين روش در مؤسسات تحقیقاتي در انگلستان، فرانسه، كانادا و مراكز تحقیقاتي بین المللي ازجمله سیمیت و ايكاردا آغاز گرديد ) . ( ,Inagaki 1997 2001Zheng et al., )در ايران نیز برنامه ھاي به نژادي ھاپلوئیدي گندم در قالب چندين فقره طرح تحقیقاتي در مؤسسه اصلاح بذر اجرا شده و منجر به ارائه چندين لاين پرمحصول مقاوم به زنگ و رقم زراعی "بم" متحمل به شوري و چندین لاین امید بخش زودرس متحمل به گرما شده است (بزرگي پور ،a 1373بزرگي پور ،b 1373بزرگي پور و ھمكاران ،1378مجیدي و وھابزاده، 1378و، بزرگی پور و ھمکاران .)

در ادامه به یکی از برجسته ترین تحقیقات صورت گرفته در این زمینه اشاره خواهد شد.

در اين تحقیق به منظور تولید لاين ھاي دابلد ھاپلوئید، مقاوم به زنگ ھای غلات زنگ زرد، قھوه ای و سیاه (نسل ھايF1و حاصل از تلاقی ارقام و لاینھای گنید، مروارید -N 90-7و N-87-20) استفاده می شود. بذور F1 مستقیما جھت استخراج لاین ھای دبلد ھاپلوئید در گلخانه کشت خواھند شد. اما در مورد نسل F2 از بوته ھای انتخاب شده در شرایط مزرعه ای بعد از انجام تلقیح با اسپور بیماریھای زنگ زرد، قھوه ای و فوزاریوم در ایستگاه گرگان استفاده خواھند شد. در پایان فصل زراعی بذور بوته ھای انتخاب شده برداشت شده و جھت تولید لاینھای دبلدھاپلوئید در شرایط گلخانه و مزرعه کرج کشت خواھند شد.در نھایت لاین ھای دبلد ھاپلوئبد تولید شده نسبت به ھر سه زنگ در شرایط گلخانه و ھمچنین در شرایط مزرعه ارزیابی خواھند شد.

سیستم تولید ھاپلوئید در گندم از طريق تلاقي با ذرت با استفاده از پديده حذف كروموزومي خواھد بود. روشھاي تولید ھاپلوئید در اين سیستم شامل :

1ـ كلاسیك يا متداولInagaki,) 1997 detached spikes)

2ـ سنبله جداشدهLaurie and Bennett,) 1988)

روش كلاسیك يا متداول (Laurie and Bennett, 1988) :

گیاھان گندم و ذرت در گلدان در گلخانه در دماي Cْ25-20و شرايط نوري 8:16 تاريكي، نور كشت مي شوند. در زمان گل انگیزي گندمھا عقیم شده و روز بعد توسط دانه گرده ذرت بارور مي شوند. گیاھان گندم يك روز بعد از گرده افشاني با ھورمون (D 10mg/l2,4 )توسط سرنگ انسولین درمیان گره بالايي قبل از سنبله تزريق مي شوند. چھارده الي 18روز بعد از گرده افشاني سنبله ھاي گندم حاوي بذور نارس از گیاھان مادر جدا شده و در شرايط استريل بذورنارسي از سنبله ھا جدا و ضدعفوني مي شوند بعد از ضدعفوني سطحي جنین ھاي نارس از داخل بذور با استفاده از میكروسكوپ بینوكولار خارج و در محیط كشت Gamborg’s B5كشت مي شوند. يك ھفته الي 10روز بعد از كشت در شرايط فیتوفترون Cْ20 ±2و شرايط نوري 16:8گیاھچه ھاي ھاپلوئید ظاھر خواھند شد. زمانیكه گیاھچه ھا به حد نصاب كافي رشد ساقه و ريشه رسیدند به گلدھانھاي حاوي 3/1ماسه 3/1پیت ماس و 3/1خاك رس و استريل شده انتقال مي يابند. در مرحله سه برگي )حدود 15سانتیمتر ارتفاع( گیاھچه ھا در محلول كلچیسین )% (Colchicine 0.05به مدت 5ساعت قرار مي گیرند. پس از شستشوي ريشه ھا در آب، گیاھچه ھا مجدداً به گلدان ھا منتقل مي شوند. زمانیكه گیاھان به مرحله رسیدگي فیزيولوژيكي رسیدند بذور دبلدھاپلوئید آن ھا برداشت مي شود. جھت اطمینان از تعداد كروموزومھا گیاھچه ھاي ھاپلوئید و ھمچنین بذور دبلدھاپلوئید با استفاده ازروش اسكواش شمارش كروموزمي مي شوند. پس از يك نسل تكثیر كه بمنظور خالص سازي بذور از اثرات كلچیسین و ھمچنین تكثیر بذور انجام مي شود بذور لاين ھاي دبلدھاپلوئید حاصل خواھد شد.

روش سنبله قطع شده (Inagaki, 1997) :

گیاھان گندم و ذرت طبق روش كلاسیك در گلخانه كشت مي شوند در مرحله گلدھي ساقه ھاي گندم از سطح خاك قطع شده و انتھاي ساقه ھا در يك بشر حاوي آب قرار داده مي شود. قبل از عقیم كردن سنبله ھاي گندم، آن ھا را به مدت 3دقیقه در آب گرم با دماي C ْ43قرار مي دھیم بعد از عقیم كردن سنبله ھا را مجدداً در بشر حاوي آب قرار داده و با استفاده از يك پوشش پلاستیكي آن ھا را پوشانیده و در فیتوفترون Cْ5/22و 16:8قرار مي دھیم. 24ساعت بعد از عقیم نمودن نسبت به تلقیح آن ھا با دانه گرده ذرت اقدام مي نمائیم. 24ساعت بعد از گرده افشاني سنبله ھا را در محیط كشت حاوي ساكاروز gr/L40و اسید سولفورز mg/L8و mg/L2,4-D100قرار مي دھیم. 48ساعت بعد ساقه ھاي بريده شده از محیط كشت فوق خارج و به محیط كشت مايع بدون D-2,4منتقل مي شوند. سپس ھر دو روز يكبار انتھاي ساقه ھا توسط قیچي برش داده شده و مجدداً درون محیط كشت قرار مي گیرند. 12الي 14روز بعد از گرده افشاني با توجه به مورفولوژي سنبله ھا نسبت به نجات جنین ھا اقدام مي شود.

.در اين پروژه ھمچنین مقايسه و ارزيابي كارايي چھار روش: ساقه ھاي بريده شده بدون حذف گلچه ھاي وسط، ساقه ھاي بريده شده با حذف گلچه ھاي وسط، روش بینابیني بدون حذف گلچه ھاي وسط، روش بینابیني با حذف گلچه ھاي وسط، در میزان تولید ھاپلوئید و دابلد ھاپلوئید در گندم پرداخته خواھد شد.

ھمچنین غلظت ھای مختلف D 1%، 2%-2,4و %3گرم در لیتر در محلول غذایی سوکروز و روش ھای مختلف عقیم سازی نظیر گلوم دست نخورده، بریدن گلوم با قیچی، بریدن نوک پرچم نارس و زمانبندی قرار دادن پنجه ھای در محلول غذایی مورد ارزیابی قرار خواھند گرفت. مقایسات بر اساس درصد تشکیل بذر، درصد تشکیل جنین، و در نھایت درصد تولید گیاھان ھاپوئید با استفاده از آزمون مربع کای انجام خواھند پذیرفت.

در ارزیابی گلخانه ای تعداد ی بذر از ھر رقم داخل تشتك پتري روي كاغذ صافي مرطوب و دماي C20در داخل ژرمیناتور براي جوانه زني قرار داده می شوند. 48ساعت بعد ازجوانه زدن بذور در گلدانھایي به قطر 15سانتیمتر حاوي 2قسمت خاك، 1قسمت خاك برگ و 1قسمت ماسه كشت و در دماي C20-15نگھداري می شوند. تلقیح در مرحلة 12در مقیاس زادوکس و ھمکاران ) (Zadoks et al., 1974انجام شد. روش مایه زنی بصورت گرده پاشي با پودر تالك به نسبت 4:1انجام می شوند. بعد از تلقیح ابتدا گلدانھا به مدت 24ساعت به تاريكخانة با C10و رطوبت در حد اشباع منتقل و سپس در گلخانة با دمای C15منتقل و نگھداري می شوند. براي اندازه گیري اولین جزء مقاومت، دورة كمون، كه بیانگر تعداد روز از زمان مایه زنی تا ظھور اولین جوشھاي زنگ بر روي برگھا مي باشد، 8روز بعد از مایه زنی ، اولین جزء مفاومت بر اساس تعداد روز از زمان مایه زنی تا مشاھدة اولین جوش يادداشت برداري می شود. اين عمل تا 20روز بعد از مایه زنی ادامه می یابد. روز بیستم دومین جزء مقاومت، تیپ آلودگي به روش مک نیل و ھمکاران ) (McNeal et al., 1971يادداشت برداري می شود.

به منظور ارزيابي مقاومت گیاه بالغ بذور ھر لاين در دو خط يك متري و به فاصلة بین خطوط cm30كاشته خواھد شد. به منظور استقرار بیماري، اطراف قطعة آزمايشي و ھمچنین به فاصلة ھر 5شماره از رقم حساس بولاني كشت می گردد.

آزمایش در شرایط مزرعه در ایستگاه تحقیقاتی قراخیل ساری مورد ارزیابی قرار می گیرد. آزمايش اواخر آذر)مرحلة گیاھچه اي(، اواسط بھمن و اسفند )مرحلة پنجه زني( واواسط فروردين بوسیله مخلوط پودر تالك و اسپور نژاد منطقه تلقیح میگردد. یادداشت برداری در مرحله ظھور برگ پرچم صورت خواھد گرفت. يادداشت برداري از بیماري درمرحله ظھور برگ پرچم و حتي الامكان پس از رسیدن میزان بیماري رقم حساس )بولاني( به حد نھايي از طريق تعیین درصد پوشش آلوده سطح برگ ) (0-100بر اساس روش اصلاح شده كاب) (The modified Cobb scaleانجام میشود) .(Peterson et al.,1948ھمچنین از واكنش گیاه به آلودگي )تیپ آلودگي( بر اساس روش رولفز و ھمکاران )(Roelfs et al., 1992يادداشت برداري خواھد شد